木质素是地球上数量上仅次于纤维素的有机物，占生物圈有机碳的30%(李金花等, 2007)。木质素是包围在木纤维等管束细胞和厚壁细胞壁外的一类物质，由苯丙烷衍生物以醚键或碳键(少数)连接而成，其分子量从几百到几百万。由于木质素是由香豆醇、松柏醇和芥子醇三种不同的单体聚合而成，因此可将木质素分为紫丁香基木质素(S-木质素)、愈创木基木质素(G-木质素)和对一羟基苯基木质素(H-木质素)3种类型(付伟等, 2004, 生物学通报, 39(2): 12-14)。木质素是维管植物进化过程中的结构产物之一，在细胞壁木质化过程中，逐步渗入到细胞壁，填充于纤维素构架内，加大了细胞壁的硬度，增强了细胞的机械支持力或抗压强度，促进机械组织的形成，又由于木质素具有高硬度、水不溶性、难降解以及多酚类物质的化学特性，使得它在植物体中起着支持植物体、水分输导以及增强抵抗病虫害等的重要作用(陈永忠等, 2003)。

紫外差异显微镜和扫描电子显微镜分析表明，木质素合成最初发生在原生细胞壁中，然后沿着径向壁扩展；次生壁的木质化比细胞角发生得更早一些，在多糖合成活跃的位置木质化速度较慢，初生木质部中的射线细胞也能以加厚的方式沉积木质素(林鹿等, 1998)。木质素的合成首先是通过莽草酸途径在一系列酶的催化作用下转化为芳香族氨基酸(如苯丙氨酸, 酪氨酸和色氨酸等)，在苯丙氨酸解氨酶PAL的作用下形成反式肉桂酸，经过甲基化酶等一系列反应形成木质素单体，最后木质素单体聚合形成木质素(李伟等, 2003)。如图1所示。本文综述了一些木质素生物合成相关酶基因的研究进展，意在为解决更多实际应用中的问题和改良植物品质提供依据。

图1 木质素合成一般途径(Jeroen et al., 2003) 注: PAL: 苯丙氨酸氨基裂解酶; C4H: 肉桂酸-4-羟基化酶; 4CL: 4-香豆酸辅酶A连接酶; C3H: 香豆酸-3-羟基化酶; CCoAOMT: 咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶; CCR: 肉桂酰辅酶A还原酶; CAD: 肉桂醇脱氢酶; SAD: 芥子醇脱氢酶; COMT: 咖啡酸/5-羟基阿魏酸-O-甲基转移酶; F5H: 阿魏酸-5-羟基化酶; HCT: 莽草酸/奎宁酸羟基肉桂酰转移酶 Figure 1 The monolignol biosynthetic pathway (Jeroen et al., 2003) Note: PAL: phenylalanine-ammonia-lyase; C4H: Cinnamate4-hydroxylase; 4CL: 4-hydroxycinnamoy-CoAligase; C3H: p-coumarate3-hydroxylase; CCoAOMT: Caffeoyl-CoA O-methyltransferase; CCR: Cinnaamoyl-CoA reductase; CAD: Cinnamyl-alcohol dehydrogenase; SAD: Sinapyl alcohol dehydrogenase; COMT: Caffeic/5-hydroxyferulic acid O-methyltransferase; F5H: Ferulate5-hydroxylase; HCT: shikimate/quinate hydroxyeinnamoyhransferase

1木质素单体的合成
木质素单体的合成是经过苯丙酸途径进行的，首先苯丙氨酸(或酪氨酸)脱氨形成肉桂酸，而后通过羟基化、甲基化及还原反应，最终生成木质素的3种主要单体。

1.1苯丙烷类代谢途径的起始反应
苯丙烷类代谢途径起始反应涉及两种酶，分别是苯丙氨酸解氨酶(PAL)，酪氨酸解氨酶(TAL, 仅存在于草本植物中)(金顺玉等, 2008)。

1.1.1苯丙氨酸解氨酶(PAL)
苯丙氨酸解氨酶(Phenylalanine Ammonia-Lyase, PAL)催化L-苯丙氨酸脱氨生成反式肉桂酸，是苯丙烷类代谢途径的限速酶，PAL对苯丙烷类代谢起一个总开关作用，它并非特异地参与木质素单体的合成，它同时也是非木质素酚类物质合成的中间环节。木质素含量的下降最早在抑制PAL表达的转基因烟草中发现，研究发现当PAL的表达受到抑制时，它们的生长发育亦受到了严重的影响(章霄云等, 2006)。魏建华等的研究表明：只有PAL抑制到一定程度时才影响木质素的合成，而且抑制PAL的转基因植物木质素含量下降的同时还伴随着植物体非正常生长(魏建华等, 2001)。宋福南等(2009)对白桦苯丙氨酸解氨酶(PAL)基因的分离及其表达的研究说明：PAL基因在不同组织中的表达是有差异的，可能行使不同的功能。由于PAL可以严重影响植物的生长发育，所以在改良植物品质提高植物生长的研究中应该更加重视PAL的研究，又由于它在不同植物和组织中的表达和功能不同，所以研究同一植物不同组织之中PAL的表达和功能，可以更明确地改良某一植物特定组织的品质。

1.1.2酪氨酸解氨酶(TAL)
TAL也位于苯丙酸途径的入口，与PAL不同的是TAL仅存在于禾草类植物中，而且TAL催化酪氨酸脱氨直接生成4-羟基肉桂酸。在稻科植物中，木质素生物合成的一个分支就是酪氨酸在酪氨酸解氨酶(TAL)的作用下转化为对香豆酸，而酪氨酸解氨酶(TAL)是该途径的限速酶，其酶活性随着植株的肥大生长而随之增大(薛永常等, 2003)。近来发现TAL的cDNA在E coli.中表达,同时具有PAL与TAL酶活性(杨淑蕙, 2001)。因此，在禾本类植物枝干的粗壮生长时应注重TAL的表达对其的影响。

1.2羟基化反应
羟基化反应的酶催化的是三种木质素单体之间的转换，控制羟基化反应的关键酶可以改变木质素的组成，如使S-木质素含量升高。此反应涉及肉桂酸4-羟基化酶(C4H)、对香豆酸3-羟基化酶(C3H)、阿魏酸-5-羟化酶(F5H)、4-香豆酸辅酶A连接酶(4CL)和莽草酸/奎宁酸羟基肉桂酰转移酶(HCT)5种酶。

1.2.1肉桂酸4-羟基化酶(C4H)
C4H是苯丙烷类代谢途径的第一个羟基化酶，属于CYP73亚家族、与细胞色素P450有关的单氧化酶。C4H能利用PAL反应产物肉桂酸,催化肉桂酸C4位置羟基化形成对-羟基香豆酸。Chen等(2007)用29种苯丙烷类似物作为底物对C4H进行底物特异性研究发现，其中9种带不同芳香环的苯丙烷衍生物能够被C4H催化使其发生羟基化反应，且具有较高的催化活性。在杨树中，C4H活性与木质素和厚壁组织相联系，可被真菌处理、真菌感染、受伤及化学诱导剂所诱导(Hu et al., 1999)。Logemann等(1995)的研究指出在将多酶复合体固定到内质网上的过程中，C4H在其中起着结构支架作用。

1.2.2香豆酸-3-羟基化酶(C3H)
C3H是木质素苯丙烷代谢途径中的关键酶之一，属于细胞色素P450单氧化酶，催化对/香豆酰莽草酸/奎宁酸(p-coumaroyl shikimate/quinate)-咖啡酰莽草酸/奎宁酸(caffeoyl shikimate/quinate)的C3位置的羟基化反应。木质素生物合成的第一个有关的步骤是对羟基苯乙烯酸或它的衍生物盐的羟基化，木质素生物合成模型认为此步是发生在自由酸水平是由C3H催化的。Franke等(2002)从拟南芥突变体中分离到REF基因，该基因的原位杂交表明它是CYP98A3，实验证明CYP98A3就是C3H。聂会忠等(2008)人对杨树木质素合成酶C3H基因的克隆及其序列分析的研究发现不同物种在长期的进化过程中，其核酸信息发生了不同进化，C3H的遗传特性也发生了巨大变化，木质素单体在裸子植物、被子植物中的组成也不同。杨学文等(2009)人研究指出：下调C3H的表达既能降低木质素含量又能改变单体组成，可以大大节约植物造纸成本，提高饲草的适口性。虽然，我们对C3H在木质素合成有了初步研究和了解，研究它在不同的植物组织器官中将发挥怎样的作用，会为植物体的综合利用提供帮助。

1.2.3阿魏酸-5-羟基化酶(F5H)
F5H催化苯丙烷途径阿魏酸、松柏醛和松柏醇的不可逆羟基化形成芥子酸，并进行S-木质素生物合成。Osakabe等(1999)从香枫中得到一种细胞色素P450单氧化酶基因，即F5H，它能催化松柏醛进行5一羟基化反应，介导芥子醛的合成，Kcat/Km值显示，F5H对松柏醛的催化效率比催化阿魏酸的高。付月等(2006)在木质素合成酶基因F5H的克隆及其鉴定中指出：F5H是S-木质素合成中必需的酶基因，在拟南芥fahl突变体中，当F5H活性降低时，几乎全部为G-木质素；在转基因拟南芥、烟草与杨树中，F5H的过量表达时，S/G显著增加。由此可以推断F5H 的催化作用是S-木质素合成中的必须环节。另外，Rugger等(1999)研究发现在拟南芥中F5H在根、茎、叶、花、果和种子中均表达，并且在叶和种子不同时期表达量不同。由此，我们可以通过对木质素F5H在植物不同组织及统一组织不同时期表达量的不同，来控制植物各组织个单体木质素的合成，从而达到人类预期的效果。

1.2.4 4-香豆酸辅酶A连接酶(4CL)
4CL是控制木质素生物合成、催化羟基肉桂酸酮生成G或S型木质素单体途径中的关键限速酶基因。它是苯丙烷类代谢途径的最后一个酶，也是植物天然苯丙烷类代谢产物合成的分歧途径中一个必须酶。4CL同工酶具有不同底物特异性和生物化学特性，它的不同表达可调节3种木质素单体聚合成不同类型的木质素(薛永常等, 2003)。贾彩红等(2004)研究发现，抑制4CL基因的表达不仅使木质素含量减少，纤维素含量增加，还伴随转基因植株生长加快。梁海泳等(2006)人对UGPase和反义4CL基因对转基因烟草纤维素和木质素合成的调控的研究表明：增强尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(UGPase)基因的表达可提高转基因植株的纤维素含量，但对木质素含量没有影响；抑制4CL基因的表达可显著降低转基因植株的木质素含量，但对纤维素含量没有影响；转移双价基因的转基因植株中纤维素含量增加而木质素含量降低。由以上的相关研究我们可以发现：促进或抑制4CL基因的表达可以显著调节木质素/纤维素的相对比例，因此我们可以对棉花等纤维植物的纤维中4CL表达的调控而改良其纤维的品质，使这些植物由更高的经济价值。

1.2.5莽草酸/奎宁酸羟基肉桂酰转移酶(HCT)
莽草酸/奎宁酸羟基肉桂酰转移酶(shikimate/quinate hydroxyeinnamoyhransferase, HCT)是木质素生物合成途径中研究最晚的一种酶,在苯丙烷C3羟基化的上、下游起着双重调节作用，控制木质素G/S单体生物合成，是H一单体和G/S一单体生物转换的重要控制点，对木质素的含量具有重要作用(Raes et al., 2003; Reddy et al., 2005)。Shadle等(2007)对在紫花苜蓿中羟基化转移酶影响木质化的研究表明，HCT的下调调节可以改变木质素的含量及单体比例，提高饲料的消化率。

1.3甲基化反应
木质素单体生物合成需经3’和5’位置的两步甲基化反应。此反应过程中涉及咖啡酸/5-羟基阿魏酸-O-甲基转移酶(COMT)与咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶(CCoAMT)两个不同底物水平上的甲基化酶。

1.3.1咖啡酸/5-羟基阿魏酸-O-甲基转移酶(COMT)
COMT是苯丙烷代谢途径中的一个甲基化酶，Goujon等(2003)研究指出，在用插入突变获得的拟南芥Atomd突变体中，当缺乏COMT活性时，几乎不生成S-木质素，但却出现了大量5-羟基-G木质素(S木质素的前体)。Jouanin等(2000)研究发现，在转基因杨树中当COMT活性几乎被全部抑制时，木质素含量降低。由此可见，在转基因植物中木质素的含量受COMT活性被抑制程度的影响。

1.3.2咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶(CCoAMT)
CCoAOMT是木质素合成中另外一个催化甲基化作用的酶，CCoAOMT最早被发现于裸子植物的松树中，Li等(1999)对次生木质部中CCoAOMT的表达对木质素生物合成途径的重要作用的研究指出，CCoAOMT对咖啡酰CoA的活力是5-羟基阿魏酰CoA的3.2倍，这就进一步证实了松树中主要含G-木质素。Zhong等(1998)对转基因烟草的研究发现，当CCoAOMT反义表达时，总木质素含量下降，但G-木质素含量的减少比S-木质素多，即S/G比值增加。Guo等(2001)在转基因苜蓿中，CCoAOMT被抑制造成G-木质素下降50％。但对S木质素没有影响。黄春琼等(2008)对反义CCoAOMT基因调控烟草木质素的生物合成研究指出：用农杆菌介导法导入苎麻反义CCoAOMT基因的烟草与野生型对照相比木质素平均含量降低，而纤维素平均含量升高，并且植株生长。由此推测CCoAOMT对G-木质素合成有调控作用，而且可以通过对CCoAOMT基因表达的调控而改善纤维植物的纤维品质。

1.4还原反应
木质素生物合成途径中的还原酶主要有两种，即肉桂酰辅酶A还原酶(CCR)和肉桂醇脱氢酶(CAD)。

1.4.1肉桂酰辅酶A还原酶(CCR)
肉桂酰辅酶A还原酶(cinnmnoy l-CoA reductase, CCR)是木质素生物合成特异途径的第一个关键酶，CCR作为催化木质素生物合成的氧化还原反应的第一个酶，它控制木质素合成途径中碳素的进入,还可催化3种羟基肉桂酸的CoA酯还原生成相应的肉桂醛，因此它可能是木质素生物合成的限速酶之一，而且CCR的活性强弱决定了植物体总木质素含量的多少(赵华燕等, 2004)。赵文超和薛永常(2009)、薛永常等(2008)等对杨树中CCR基因研究也证明了，CCR是木质素特异途径的第一个关键酶，而且决定了植物体的总木质素含量。如果通过基因工程手段调节木质素生物合成途径中的该基因表达以调控CCR的活性，降低植物木质素含量，对植物的综合利用起到重要的作用。

1.4.2肉桂醇脱氢酶(CAD)
CAD催化G-型木质素单元和S-型木质素单元形成的最后一步反应，Halpin等(1994)通过CAD活性的抑制调控木质素品质的研究中指出，在转基因烟草中降低CAD的活性，醛醇比的变化较大，表明松柏醛的还原被抑制程度相对较高，由此推测CAD可能具有底物选择亲和性或者存在不同的CAD同工酶。Baucher等(1999)研究发现：抑制CAD活性木质素分子中S残基含量降低，苜蓿木质素的S/G比率下降。Pilate等(2002)通过对杨树中CAD反义抑制发现，木质素含量改变甚微，但其组成与结构发生较大的变化。由此可见，CAD在植物组织的木质素合成过程中起着非常重要的作用，是木质素苯丙烷途径中还原反应的重要调节酶。

2木质素单体的聚合
木质素单体合成以后,需要脱氢聚合才能形成木质素。最初证明漆酶在有氧的条件下能够产生木质素，以后又发现过氧化物酶(POD)可有效地催化该聚合反应，它通过催化各种木质醇单体发生脱氢聚合反应，参与并调节木质素在细胞壁的聚合过程。

2.1过氧化物酶(POD)
在过氧化物酶(Peroxidase, POD)是在木质素合成的最后一步起作用的酶，它通过催化各种木质醇单体发生脱氢聚合反应，参与并调节木质素在细胞壁的聚合过程，使植物细胞壁的伸展性发生改变，对植物生长也有调节作用(Shadle et al., 2007)。一些植物中几种参与木质素合成反应的过氧化物酶同工酶己分离出来。Zwliha等(1999)利用过氧化物酶基因Shpx6a，反向转入杨树，木质素含量降低，表明过氧化物酶确实与木质素单体聚合有关。吴晓丽等(2008)对离体毛竹笋纤维素和木质素含量及POD和PAL活性研究证明：离体后贮藏的竹笋纤维素、木质素含量随贮藏时间的延长而增加，同时，POD活性随贮藏时间的延长，活性均显著增加，而且，低温对纤维素的影响高于木质素。由此，我们可以通过调节温度来调节纤维素/木质素的比例，从而提高相应植物的品质。

3结语与展望
3.1木质素合成途径中相关酶基因的调控
综上所述，如表1所示，大量试验证明，利用现代生物技术和基因工程手段在杨树、烟草、苜蓿等植物中，通过调节木质素单体生物合成中CCoAOMT、CAD、4CL、F5H等单个酶基因的活性，可以改变3种木质素单体的相对比例及连接键的类型，可成功降低木质素含量，改变其组分，从而达到改善改善纤维植物的纤维品质，使其具有更高的经济效益。然而由于木质素的合成与多个酶有关，不同酶系之间有多种相互作用，所以抑制单一酶的表达活性，往往会造成顾此失彼的结果，如将反义PAL基因转化到杨树中的实验发现，转基因植株虽然木质素含量降低了，但植物出现了非正常生长(薛永常等, 2003)。因此，在不影响植物正常生长的前提下，选择合适的基因、合理调控各基因间的相互作用对于调控木质素生物合成是很重要的。Zhao等(2002)将CAD与CCoAOMT反义基因以共整合载体方式导人烟草中，发现2个基因同时被抑制引起的木质素含量下降程度比单基因分别抑制时要显著。Abbott等(2002)利用3个正义基因结构CAD2/COMT/CCR进行了烟草转化，所获得转基因烟草的木质素含量明显减少。由此可见，与以往抑制单个基因表达相比，利用双价和多基因的共抑制结构，能更有效地调控植物体内木质素合成途径。

表1 木质素生物合成相关基因的研究进展 Table 1 Recent advance in study of lignin biosynthesis gene

3.2转基因研究中启动子的选择
在苯丙烷代谢途径中几个特异性表达的启动子已被克隆，如CAD、4CL、COMT和PAL基因的启动子(Capellades et al., 1996; Feuillet et al., 1995; Hauffe et al., 1993)。但由于这些启动子本身的表达效率不够高，所以转基因抑制木质素合成的研究极少使用此类启动子。大部分关于木质素合成生物调控的遗传操作都选用组成型强启动子CaMV 35 S，它能启动所转入的基因在所有植物组织中进行非特异性表达， 这可能对植物的正常生长及抗逆性造成负面影响。Jouanin等(2000)通过对抑制COMT活性的转基因杨树的木质化研究指出，通过对CaMV双35S启动子构建的表达载体与桉树CAD启动子构建的表达载体分别转入杨树的对比发现，含有CaMV双35S启动子表达载体的杨树中COMT活性几乎被全抑制，而含有桉树CAD启动子构建的表达载体的杨树只有部分抑制。显然，使用木质化部位特异性表达的启动子，比使用组成型启动子更有利于保持植物的抗逆性。通过基因克隆等技术优化特异性表达的启动子，使其表达效率得到提高，成为木质素合成生物调控的遗传操作的首选启动子将是以后研究的重要方面。并且，继续通过研究构建出木质素合成途径中其他基因的启动子，使在此方面的研究更方便，研究效率更高。

3.3木质素生物合成中转录调控
尽管目前还不清楚转录因子直接激活木质素生物合成中的哪些基因，但是几个MYB基因已经被研究，它们可能参与调控苯丙烷代谢途径(Rogers et al., 2004; Deluc et al., 2006; Fornale et al., 2006)。这些MYB蛋白通过与启动子区的AC顺式作用元件相结合来调控苯丙烷生物合成中相关基因的表达。然而，仅仅有包括来自于松树的PtMYB4 (Patzlaff et al., 2003)和来自于桉树的EgMYB2 (Goicoechea et al., 2005)在内的几个MYB基因被认为与木质结构和木质素生物合成有关。PtMYB4与EgMYB2在次生木质部表达，并且与木质素生物合成基因启动子中的AC顺式作用元件相结合，它们在烟草中发生过表达时，可以对木质素生物合成基因进行正向调控。另外，过表达的PtMYB4导致沉积木质素的异位，而且过表达的EgMYB2可能通过增加木质素的沉积而使纤维素和微管中的次生壁加厚。虽然目前还没有PtMYB4与EgMYB2功能的相关证据，但是现有的一些资料指出，它们与木质素生物合成途径的转录调控有关。此外，来自于白杨的MYB基因PttMYB21a在木质形成时期表达，而且它的过表达对木质素合成中的一个甲基化酶COMT的表达有抑制作用(Karpinska et al., 2004)。除此之外，LIM转录因子可以结合启动子区的Pal box顺式作用元件，在转基因烟草中，下调LIM基因，抑制木质素的生物合成(Kawaoka et al.,2000)。因此，进一步研究转录因子如何共同调控木质素的生物合成是十分重要的。

3.4木质素在生产应用中的研究
大多数人研究木质素是基于木材中木质素的研究，以期对以木材利用为主的造纸工业及牧草利用过程当中存在许多不利的因素的改善，通过调节木质素合成中关键酶基因的表达，以改变木质素的含量或单体组成，以满足工业不同用材的需要及畜牧用草的需要，提高其在实际应用中的效率。其实在许多植物中都存在木质素，而且在不同的组织器官中其功能也不同，因此通过对各种植物中不同组织器官中木质素的研究，来研究木质素的更多功能，从而解决更多实际应用中的问题和改变植物的不良品质。例如降低植物中木质素总含量，减少造纸行业对环境污染及提高饲料植物的消化率和利用率(Guo et al., 2001)，这将具有十分美好的经济前景。

作者贡献
倪志勇、吕淑萍是本研究的实验设计和实验研究的执行人；倪志勇及吕淑萍完成数据分析，论文初稿的写作；吕淑萍参与实验设计，试验结果分析；范玲是项目的构思者及负责人，指导实验设计，数据分析，论文写作与修改。全体作者都阅读并同意最终的文本。

致谢
本研究由农业部转基因重大专项课题(2009ZX08005-011B)、国家自然科学基金项目(31060173)、国家“863”项目(2006AA10Z184)、新疆自治区高技术研究发展计划项目(200611101)共同资助。

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